Thomas Bartholin nació el 20 de octubre de 1616 en Copenhague, Dinamarca.
Fue el segundo de los seis hijos de la famosa familia Caspar y Anna (Fincke) Bartholin. Su padre era profesor de anatomía y religión en la Universidad de Copenhague.
Ingresó en la Universidad de Copenhague en 1634 y luego decidió estudiar medicina. Posteriormente obtuvo su título de médico en la Universidad de Basilea.
Realizó contribuciones destacadas en las ciencias anatómicas durante el siglo XVII. Como estudiante, estuvo expuesto al entorno académico de eminentes universidades europeas como Leiden y Padua, lo que contribuyó significativamente a su perspectiva progresista hacia los avances en las ciencias médicas. 
En 1640, amenazado de tuberculosis pulmonar, se fue a París, luego a Orleans y Montpellier, y finalmente a Padua, donde recuperó la salud.
En Leiden, con la ayuda de Sylvius (Franciscus de le Boe) y Johannes de Wale, produjo en 1641 la primera de las muchas ediciones revisadas de las Institutiones anatomicae de su padre (1611).
En el invierno de 1643-1644, visitó Roma y Nápoles, donde se ganó la amistad duradera de Marco Aurelio Severino; en la primavera siguiente visitó Sicilia y Malta.
En Messina se le ofreció, pero se negó, una cátedra de filosofía.
Durante este tiempo, escribió una tesis (nunca publicada) sobre los dientes de los tiburones fósiles (glossopetrae), que se pensaba que tenían valor como medicina. Cuando regresó a Padua, produjo un tratado relacionado, De Unicornu (1645).
Después de que Bartholin se trasladó a Basilea, donde obtuvo el título de médico, en octubre de 1646 regresó a Copenhague y se unió a la facultad de la universidad.
Después de enseñar matemáticas durante un tiempo, en 1649 Bartholin fue elegido para suceder a Simon Paulli en la cátedra de anatomía. Así se introdujo la anatomía de Padua en Copenhague.
Los continuos ataques de cálculos renales lo obligaron a dejar sus funciones anatómicas en 1656, tras lo cual centró su atención en una gama más amplia de problemas médicos. Su Dispensatorium hafniense (1658) fue la primera farmacopea danesa.
Como el médico más distinguido de Dinamarca y muy estimado por el rey, Bartholin fue responsable del decreto real de 1672 que decidió la organización de la medicina danesa durante los próximos cien años.
En 1673 estableció el primer examen de partería en Copenhague, y ese mismo año comenzó la publicación de la primera revista científica danesa, Acta medica et philosophica hafniensa.
Su salud siguió deteriorándose y en 1680 Bartholin vendió Hagestedgaard y regresó a Copenhague, donde murió un 4 de diciembre.
Fue un ferviente defensor de la teoría de la circulación de William Harvey y adoptó el enfoque basado en el método de Harvey para sus propios experimentos científicos.
Bartholin llevó a cabo múltiples disecciones de cadáveres humanos y observó que los vasos lácteos (que transportaban líquido linfático blanquecino) y los vasos linfáticos (que transportaban líquido linfático transparente) no entraban en el hígado (la teoría predominante durante ese período).
Más bien, observó, estaban drenando hacia el conducto torácico, que a su vez vacía su contenido en sangre circulante al abrirse en la vena subclavia izquierda.
Sus hallazgos corroboraron los de Jean Pecquet, quien había informado de observaciones similares en animales.
Los esfuerzos de Bartholin fueron fundamentales para el descubrimiento del sistema linfático en humanos y el establecimiento del mismo como un componente independiente del sistema circulatorio. Bartholin fue un escritor prodigioso y su tratado anatómico más notable fue "Institutiones Anatomicae", que también incluyó un texto escrito por su padre Caspar Bartholin, el Viejo.
A lo largo de su vida, escribió numerosas cartas en las que discutía sus hallazgos en detalle con sus colegas y contemporáneos.
Fue un pionero de las tendencias, ya que publicó la mayoría de estas comunicaciones como documentos científicos válidos para futuras referencias.
Sus hazañas fueron fundamentales para la evolución de las ciencias anatómicas a la forma familiar en la actualidad.
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